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Analyse LC-MS/MS du fentanyl et de ses analogues dans l’urine humaine

Résumé

Les opioïdes de synthèse comme le fentanyl et le sufentanil ont des propriétés analgésiques très puissantes. L’abus de ces antalgiques délivrés sur ordonnance (ainsi que la prolifération rapide des analogues illicites) est un sérieux problème de santé publique. Dans cette étude, nous avons mis au point une méthode simple de type « Dilute & Shoot », qui fournit, sur une colonne Raptor Biphenyl, une analyse rapide LC-MS/MS de 3 minutes 30 du fentanyl et des composés associés (norfentanyl, acétylfentanyl, alfentanil, butyryl fentanyl, carfentanil, rémifentanil et sufentanil) dans l’urine humaine.

Introduction

Ces dernières années, l’usage illicite d’opioïdes de synthèse a fortement augmenté et tous les pays font maintenant face à une véritable épidémie. Parmi les milliers d’overdoses mortelles dues aux opioïdes de synthèse, la majorité est liée au fentanyl et ses analogues. Du fait de leurs propriétés analgésiques puissantes, les opioïdes de synthèse comme le fentanyl, l’alfentanil, le rémifentanil et le sufentanil sont de puissants antalgiques aux applications médicales légitimes. Cependant, ils sont aussi extrêmement addictifs et font l'objet de nombreux abus. Par exemple, le carfentanil est un puissant anesthésiant utilisé comme tranquillisant pour les animaux de grande taille, notamment les éléphants. Il est dix mille fois plus puissant que la morphine, ce qui en fait l'un des opioïdes de synthèse les plus puissants sur le marché. L’augmentation de son usage illicite, la plupart du temps mélangé à de l’héroïne, a été reliée à un nombre considérable de décès par overdose depuis 2016. En plus de l’abus de ces médicaments délivrés sur ordonnance, l’actuelle crise des opioïdes est alimentée par la prolifération des analogues illicites comme l’acétylfentanyl et le butyryl fentanyl, qui ont été conçus spécifiquement pour contourner les contrôles et les poursuites des autorités de lutte contre les stupéfiants.

L’augmentation du nombre d’opioïdes et des décès associés s’accompagne donc du besoin grandissant d’une méthode rapide et précise permettant d’analyser simultanément le fentanyl et ses analogues. C’est pourquoi nous avons mis au point cette méthode d’analyse LC-MS/MS qui permet de mesurer le fentanyl, six analogues et un métabolite (le norfentanyl) dans l’urine humaine (figure 1). Une procédure de préparation simple de type « Dilute & Shoot » est associée à une analyse chromatographique rapide (3 minutes 30) sur une colonne Raptor Biphenyl. Cette méthode permet d’identifier et de quantifier le fentanyl et les composés associés de manière exacte et précise, ce qui la rend adéquate pour diverses applications comme les analyses de toxicologie clinique, les analyses médico-légales, les dépistages sur le lieu de travail ou encore la recherche pharmaceutique.

Figure 1 : Structures chimiques


Caractéristiques expérimentales

Préparation des échantillons

Les analytes ont été ajoutés dans un « pool » d’urine humaine. Un aliquot de 80 μl d’urine a été mélangé avec 320 μl d'une solution eau:méthanol 70:30 (dilution de facteur 5) et 10 μl d’étalon interne (40 ng/ml dans le méthanol), dans un flacon filtrant Thomson SINGLE StEP (réf. Restek 25895). Après filtration sur membrane PVDF de 0,2 μm, 5 μl ont été injectés dans le système LC-MS/MS.

Solutions étalons et échantillons de contrôle qualité (QC)

Les solutions étalons ont été préparées dans un « pool » d’urine humaine à des concentrations de 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00, 2.50, 5.00, 10.0, 25.0 et 50.0 ng/ml. Trois niveaux d'échantillons QC (0.75, 4.0 et 20 ng/ml) ont été préparés dans l’urine pour tester l’exactitude et la précision en comparant aux courbes de calibration. Les analyses ont été réalisées sur trois jours différents. Tous les standards et les échantillons QC ont été soumis à la procédure de préparation des échantillons décrite ci-dessus.

L’analyse LC-MS/MS du fentanyl et de ses analogues a été réalisée sur un instrument ACQUITY UPLC couplé à un spectromètre de masse Waters Xevo TQ-S. Les conditions instrumentales sont décrites ci-dessous et les transitions des analytes sont fournies dans le Tableau I.

Colonne analytique :

Raptor Biphenyl (5 µm, 50 mm x 2.1 mm; réf. 9309552)

Précolonne :

Cartouche Raptor Biphenyl EXP, (5 µm, 5 mm x 2.1 mm; réf. 930950252)

Phase mobile A :

0.1% d’acide formique dans l’eau

Phase mobile B :

0.1% d’acide formique dans le méthanol

Gradient

Temps (min)     %B

 

0.00              30

 

2.50              70

 

2.51              30

 

3.50              30

Débit :

0.4 ml/min

Volume d'injection :

5 µl

Température :

40 °C

Mode d'ionisation :

ESI+


Table I: Transitions ioniques

Analyte

Ion précurseur

Qantificateur des ions
produits

Qantificateur des ions
produits

Étalon interne

Norfentanyl

233.27

84.15

56.06

Norfentanyl-D5

Acétylfentanyl

323.37

188.25

105.15

Acétylfentanyl-13C6

Fentanyl

337.37

188.26

105.08

Fentanyl-D5

Butyryl fentanyl

351.43

188.20

105.15

Carfentanil-D5

Rémifentanil

377.37

113.15

317.30

Norfentanyl-D5

Sufentanil

387.40

238.19

111.06

Sufentanil-D5

Carfentanil

395.40

113.14

335.35

Carfentanil-D5

Alfentanil

417.47

268.31

197.23

Acetyl fentanyl-13C6

Norfentanyl-D5

238.30

84.15

Acétylfentanyl-13C6

329.37

188.25

Fentanyl-D5

342.47

188.27

Sufentanil-D5

392.40

238.25

Carfentanil-D5

400.40

340.41


Résultats and Discussion

Performances chromatographiques

Les huit analytes ont tous été séparés au cours d’une analyse en gradient de 2 minutes 30 (durée totale du cycle d’analyse : 3 minutes 30) sur une colonne Raptor Biphenyl (Figure 2). Aucune interférence significative de la matrice pouvant avoir un impact négatif sur la quantification des échantillons d’urine (dilués avec un facteur 5) n’a été observée. La colonne Raptor Biphenyl utilisée est une colonne de silice à particules superficiellement poreuses (« SPP ») de 5 μm. Elle a été choisie pour cette méthode, car elle offre des performances semblables aux colonnes de silice à particules complètement poreuses (« FPP ») de plus petite granulométrie, tout en générant moins de contrepression dans le système.

Figure 2 : La colonne Raptor Biphenyl sépare efficacement tous les composés cibles présents dans l’urine, sans interférence apparente de la matrice.

Echantillon blanc d'urine

Blank Urine for Comparison to Fentanyl and Analogues on Raptor Biphenyl by LC-MS/MS
LC_CF0716

Standard d'urine10 ng/ml

PeakstR (min)Conc.
(ng/mL)
Precursor IonProduct IonProduct Ion
1.Norfentanyl-d5 1.031238.3084.15-
2.Norfentanyl1.0410233.2784.1556.06
3.Remifentanil1.3410377.37113.15317.30
4.Acetyl fentanyl-13C61.691329.37188.25-
5.Acetyl fentanyl1.6910323.37188.25105.15
6.Alfentanil1.8810417.47268.31197.23
7.Fentanyl-d51.951342.47188.27-
8.Fentanyl1.9610337.37188.26105.08
9.Carfentanil-d52.041400.40340.41-
10.Carfentanil2.0510395.40113.14335.35
11.Butyryl fentanyl2.1510351.43188.20105.15
12.Sufentanil-d52.251392.40238.25-
13.Sufentanil2.2610387.40238.19111.06
Fentanyl and Analogues in Urine on Raptor Biphenyl by LC-MS/MS
LC_CF0715
ColumnRaptor Biphenyl (cat.# 9309552)
Dimensions:50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:5 µm
Pore Size:90 Å
Guard Column:Raptor Biphenyl EXP guard cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 5 µm (cat.# 930950252)
Temp.:40 °C
Sample
Diluent:70:30 Water:methanol
Inj. Vol.:5 µL
Mobile Phase
A:0.1% Formic acid in water
B:0.1% Formic acid in methanol
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.47030
2.500.43070
2.510.47030
3.500.47030
DetectorMS/MS
Ion Mode:ESI+
Mode:MRM
InstrumentUHPLC
NotesHuman urine was fortified at 10 ng/mL with target analytes. An 80 μL urine aliquot was mixed with 320 μL of 70:30 water:methanol solution (5-fold dilution) and 10 μL of internal standard solution (40 ng/mL in methanol) in a Thomson SINGLE StEP filter vial (Restek cat.# 25895). After filtering through the 0.2 µm PVDF membrane, 5 μL was injected for analysis.

Linéarité

Des réponses linéaires ont été obtenues pour tous les composés et les gammes d'étalonnage couvrent les niveaux de concentration habituels recherchés pour le dépistage des abus ou la recherche pure. En utilisant une régression linéaire pondérée de 1/x (1/x² pour le butyryl fentanyl), la linéarité de la calibration allait de 0.05 à 50 ng/ml pour le fentanyl, l’alfentanil, l’acétylfentanyl, le butyryl fentanyl et le sufentanil ; de 0.10 à 50 ng/ml pour le rémifentanil ; et de 0.25 à 50 ng/ml pour le norfentanyl et le carfentanil. Tous les analytes présentent une linéarité acceptable avec des valeurs de r² de 0.996 ou plus (Figure 3) et des écarts-type < 12 % (< 20 % pour les standards les moins concentrés).

Figure 3 : Courbes d'étalonnage


Exactitude et précision

Basée sur trois expériences indépendantes réalisées sur des jours différents, l’exactitude de la méthode pour l’analyse du fentanyl et de ses analogues a été démontrée par les rendements (%) de récupération, éloignés de moins de 10 % de la concentration nominale pour tous les composés, et ce à tous les niveaux QC. L'écart-type relatif allait respectivement de 0.5 à 8.3 % et de 3.4 à 8.4% pour les comparaisons intra et inter-jour, ce qui indique une précision de méthode acceptable (Tableau II).

Table II : Exactitude et précision pour l’analyse du Fentanyl et des composés associés dans l’urine et dans les échantillons de contrôle de qualité

 

QC Level 1 (0.750 ng/mL)

QC Level 2 (4.00 ng/mL)

QC Level 3 (20.0 ng/mL)

Analyte

Conc. moyenne (ng/ml)

Exactitude moyenne (%)

Écart type relatif (%)

Conc. moyenne (ng/ml)

Exactitude moyenne (%)

Écart type relatif (%)

Conc. moyenne (ng/ml)

Exactitude moyenne (%)

Écart type relatif (%)

Acétylfentanyl

0.761

102

1.54

3.99

99.7

2.08

19.9

99.3

0.856

Alfentanil

0.733

97.6

3.34

3.96

98.9

8.38

20.9

104

6.73

Butyryl fentanyl

0.741

98.9

6.29

3.77

94.3

6.01

20.8

104

4.95

Carfentanil

0.757

101

7.34

3.76

94.0

4.64

20.6

103

4.24

Fentanyl

0.761

102

1.98

3.96

99.1

2.31

19.9

99.6

1.04

Norfentanyl

0.768

103

6.50

4.04

101

1.84

20.1

101

2.55

Rémifentanil

0.765

102

3.42

3.97

99.2

3.68

20.8

104

4.14

Sufentanil

0.752

100

1.67

3.93

98.3

1.28

20.1

100

0.943


Conclusion

Une méthode simple de type « Dilute & Shoot » a été mise au point pour l’analyse quantitative du fentanyl et de ses analogues dans l’urine humaine. Cette méthode d’analyse est rapide, fiable et sensible avec une exactitude et une précision acceptables pour l’analyse d'échantillons urinaires. La colonne Raptor Biphenyl convient parfaitement à l’analyse de ces opioïdes de synthèse et cette méthode peut s’appliquer aux analyses de toxicologie clinique, aux analyses médico-légales, aux dépistages sur le lieu de travail et à la recherche pharmaceutique.